1. 變性：在第一輪循環(huán)前,在94℃下變性5-10min 非常重要,它可使模板DNAwan全解鏈,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復(fù)合物所造成的錯誤。變性不wan全,往往使PCR 失敗,因為未變性wan全的DNA 雙鏈會很快復(fù)性,減少DNA 產(chǎn)量.一般變性溫度與時間為94℃ 1min。在變性溫度下,雙鏈DNA 解鏈只需幾秒鐘即可wan全,所耗時間主要是為使反應(yīng)體系wan全達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟?。對于富含GC 的序列,可適當(dāng)提高變性溫度.但變性溫度過高或時間過長都會導(dǎo)致酶活性的損失。
2. 退火：這是PCR 的一個關(guān)鍵參數(shù)。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm 低5℃, 當(dāng)產(chǎn)物中包含有影響實驗的非可異性擴增帶時,以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。如果兩個引物Tm 不同，將退火溫度設(shè)定為比最di的Tm 低5℃?；蛘邽榱颂岣咛禺愋裕梢栽诟鶕?jù)較高Tm 設(shè)計的退火溫度良好行5 個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm 設(shè)計的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。退火溫度越高,所得產(chǎn)物的特異性越高。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并,只用兩種溫度(例如用60℃和94℃)完成整個擴增循環(huán), 既省時間又提高了特異性。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成,反應(yīng)中所需時間主要是為使整個反應(yīng)體系達(dá)到合適的溫度。
3. 延伸：延伸反應(yīng)通常為72℃,接近于Taq DNA 聚合酶的最適反應(yīng)溫度75℃.實際上,引物延伸在退火時即已開始,因為Taq DNA 聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃.延伸反應(yīng)時間的長短取決于目的序列的長度和濃度.在一般反應(yīng)體系中,Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成1kb 長的DNA。延伸時間過長會導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加.但對很低濃度的目的序列, 則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時間。一般在擴增反應(yīng)完成后,都需要一步較長時間(10-30min)的延伸反應(yīng),以獲得盡可能完整的產(chǎn)物, 這對以后進(jìn)行克隆或測序反應(yīng)尤為重要。
4. 循環(huán)次數(shù)： 當(dāng)其它參數(shù)確定之后, 循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA 濃度。一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多,會使PCR 產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25-30 輪循環(huán)擴增后, 反應(yīng)中Taq DNA 聚合酶已經(jīng)不足, 如果此時產(chǎn)物量仍不夠, 需要進(jìn)一步擴增,可將擴增的DNA 樣品稀釋103-105倍作為模板, 重新加入各種反應(yīng)底物進(jìn)行擴增, 這樣經(jīng)60 輪循環(huán)后, 擴增水平可達(dá)109-1010。擴增產(chǎn)物的量還與擴增效率有關(guān),擴增產(chǎn)物的量可用下列公式表示:C＝Co(1+P)n 。其中：C 為擴增產(chǎn)物量,C0 為起始DNA 量, P 為增效率, n 為循環(huán)次數(shù)。在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)，減少非特異性產(chǎn)物。
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