酶ELISA試劑盒，即酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒，是酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用廣的技術(shù)。其基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合，這種結(jié)合既不會改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。酶標(biāo)記抗體可以與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。在加入底物溶液后，底物在酶的作用下會使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，從而出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可以通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。
酶ELISA試劑盒是一種常用的生物檢測工具，主要用于定量或定性檢測樣本中的特定抗原或抗體。以下是其標(biāo)準(zhǔn)測定步驟：
1、實驗前準(zhǔn)備
試劑平衡：將試劑盒從冰箱取出，室溫平衡2030分鐘，避免溫差導(dǎo)致冷凝水影響結(jié)果。
樣本處理：根據(jù)說明書稀釋樣本（如血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清等），確保無溶血或污染。
器材準(zhǔn)備：預(yù)熱酶標(biāo)儀，準(zhǔn)備微量移液器、洗板機、吸水紙等。
2、包被（Coating）
向酶標(biāo)板孔中加入包被抗體（或抗原），4℃過夜孵育或按說明書要求條件進行。
注意：避免氣泡產(chǎn)生，可用封板膜密封防止蒸發(fā)。
3、封閉（Blocking）
棄去包被液，用洗滌緩沖液（如PBST）洗板35次，拍干。
加入封閉液（如5脫脂奶粉或BSA），37℃孵育12小時，減少非特異性結(jié)合。
4、加樣與孵育
標(biāo)準(zhǔn)品：按梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
樣本：加入待測樣本，每孔設(shè)置復(fù)孔以減少誤差。
孵育：37℃孵育12小時（競爭法可能時間不同）。
5、洗滌
棄去液體，用洗板機或手動洗板35次，每次浸泡30秒，徹d去除未結(jié)合物質(zhì)。
6、加酶標(biāo)二抗
加入酶標(biāo)記的二抗（如HRP標(biāo)記），37℃孵育3060分鐘。
7、顯色反應(yīng)
加入底物溶液（如TMB），避光顯色1030分鐘（顏色變化需肉眼可見）。
終止：迅速加入終止液（如2M H?SO?），顏色由藍變黃。
8、讀數(shù)與分析
立即用酶標(biāo)儀在指定波長（如450nm/630nm雙波長）測定吸光度（OD值）。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本濃度，或比較樣本與陰性對照的差異。
